谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 H.P. C10H17N3O6S
谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 H.P. C10H17N3O6S 基質(zhì):6%瓊脂糖凝膠配基:肝素顆粒大?。?5-165μm大流速:600cm/h工作pH:3-12每毫升蛋白結合量:10mg 操作溫度:室溫保存條件:貯存于4°C-28°C(保存溶液為20%乙醇)
谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 H.P. C10H17N3O6S
谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠H.P.用于分離純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽蛋白、其它來源的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶以及和谷胱甘肽具有親和作用的蛋白的親和層析介質(zhì)。pGEX載體表達的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合,因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作為底物,通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的,可以用含游離谷胱甘肽的緩沖液洗脫結合GST融合蛋白。
基質(zhì):6%瓊脂糖凝膠
配基:肝素
顆粒大小:45-165μm
大流速:600cm/h
工作pH:3-12
每毫升蛋白結合量:10mg
操作溫度:室溫
保存條件:貯存于4°C-28°C(保存溶液為20%乙醇)
谷胱甘肽樹脂的處理:
1. 輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器,將樹脂混成勻漿。
2. 取部分勻漿放入15mL聚丙烯管(每100mL 細菌培養(yǎng)物大約需要2mL 勻漿)。
3. 4℃ 500 g離心5分鐘,小心去掉上清。
4. 在樹脂中加入10倍柱床體積預冷的PBS,顛倒數(shù)次混勻,4℃ 500 g離心5分鐘,小心去掉上清。
5. 每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS,制成50%勻漿,顛倒數(shù)次,混合均勻,懸液冰上放置待用。
制備細胞抽提物:
1. 每100毫升培養(yǎng)物的細胞沉淀重懸于4mL PBS緩沖液中。
2. 加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。
3. 用針筒將10mL 濃度為0.2%的TritonX-100 強行注入黏稠的細胞裂解物中,劇烈振動數(shù)次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL, 4℃振動溫育10分鐘,4℃ 3000 g離心30分鐘,去除不溶性細胞碎片,上清轉(zhuǎn)移到一只新管中,加入DTT至終濃度1mmol/L。
純化融合蛋白
1.細胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和,每100毫升細菌培養(yǎng)物加2mL樹脂,于室溫輕搖30min。
2. 混合物于4℃以500 g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3. 沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS,顛倒離心管數(shù)次混勻,洗去未與樹脂結合的蛋白。
4. 4℃以500 g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5. 結合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫,也可用凝血酶、腸激酶或Xa 因子切割,釋放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脫融合蛋白:
1. 沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂上結合的蛋白。
2. 4℃以500 g離心5分鐘,上清(含洗脫的融合蛋白)移至新管中。
3. 重復步驟5和6兩次,合并3次上清。蛋白酶解從結合的GST融合蛋白上回收靶蛋白:
4. 在結合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa 因子(根據(jù)融合蛋白中的位點選擇),每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻,室溫下振蕩2-16小時。
5. 4℃以500 g離心5分鐘,上清小心移至新管中。(GST仍結合在樹脂上,而靶蛋白在上清中,蛋白酶也在上清中,仍需要分離)
6. 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成。試劑配制:谷胱甘肽洗脫緩沖液:10mmol/L還原型谷胱甘肽,50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)